Produkcja mononukleotydu β-nikotynamidu (NMN) u Escherichia coli

Abstrakcyjny

Cukrzyca jest przewlekłą i postępującą chorobą o stale rosnącym rozpowszechnieniu, rosnącą presję finansową na światowe systemy opieki zdrowotnej. Ostatnio oporność na insulinę, cechę charakterystyczną cukrzycy typu 2, wyleczono u myszy leczonych prekursorem mononukleotydu β-nikotynamidowego NAD ⁺ (NMN) , nie odnotowano żadnych efektów toksycznych. Jednak NMN ma wysoką cenę, potrzebne są bardziej opłacalne metody produkcji. W badaniu zaproponowano biotechnologiczną metodę produkcji NMN w Escherichia coli . Pokazujemy, że bicistronowa ekspresja rekombinowanej transferazy fosforybozylofosforozylowej nikotynoamidu (Nampt) i syntetazy pirofosforanu fosforofosylowego (PRPP) w obecności nikotynoamidu (NAM) i laktozy może być skuteczną strategią opłacalnej produkcji NMN. Białkowe wektory ekspresyjne niosące gen NAMPT z Haemophilus ducreyi i syntetazę PRPP z Bacillus amyloliquefaciens z mutacją L135I transformowano w Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. Produkcja NMN osiągnęła maksymalnie 15,42 mg na litr kultury bakteryjnej (lub 17,26 mg na gram białka) w tych komórkach hodowanych w pożywce PYA8 uzupełnionej 0,1% NAM i 1% laktozy.

Wprowadzenie

Według Międzynarodowej Federacji Diabetologicznej liczba osób dorosłych z cukrzycą typu 2 wyniosła w 2017 r. 425 mln, a do 2045 r. Ma wynieść 649 mln. W skali globalnej wydaje się 12% budżetu na opiekę zdrowotną (lub 727 mld USD) w leczeniu cukrzycy. Ostatnie badania połączyły insulinooporność, cechę charakterystyczną cukrzycy typu 2, ze spadkiem funkcji mitochondriów i zmniejszonymi poziomami NAD ⁺ , a także stosunkiem NAD ⁺ / NADH, również obserwowanym podczas starzenia. NAD ⁺ jest obecny we wszystkich żywych organizmach i jest dobrze znanym koenzymem w reakcjach utleniania-redukcji. Deacetylazy białkowe zależne od NAD ^+, takie jak SIRT1 i SIRT6, służą jako czujniki metaboliczne i regulują szlaki dolne, które ostatecznie przywracają funkcję mitochondriów i wrażliwość na insulinę. To odkrycie rozszerza domenę badań efektów NAD ⁺ na inne choroby zwyrodnieniowe związane ze starzeniem się, takie jak: układ sercowo-naczyniowy, rak, zapalenie stawów, osteoporoza lub choroby Alzheimera.

Mononukleotyd β-nikotynoamidu (NMN) jest półproduktem w biosyntezie NAD ⁺ wytwarzanym z nikotynoamidu (NAM) i pirofosforanu fosforybozylu (PRPP) przez enzym transferazy nikotynamidofosforybozylowej (Nampt) (EC 2.4.2.12). Będąc dobrze tolerowanym, bez doniesień o skutkach ubocznych podczas długotrwałego podawania myszom i zapobiegając spadkowi fizjologicznemu związanemu z wiekiem, NMN okazał się skuteczny w leczeniu cukrzycy typu 2 wywołanej dietą wysokotłuszczową poprzez odwrócenie dysfunkcji mitochondriów związanej ze starzeniem się i ratowanie wpływ związanego z wiekiem spadku liczby nerwowych komórek macierzystych.

NAM jest zwykle przekształcany w NMN przez enzymy zaangażowane w szlaki ratunkowe NAD ⁺ , takie jak Nampt. Działanie tego enzymu stanowi główną aktywność anaboliczną NAD ⁺ w komórce. Regulacja metabolizmu nukleotydów ssaków lub mikroorganizmów i biosyntezy zwykle przebiega przez spożycie PRPP. PRPP powstaje z rybozo-5-fosforanu poprzez zarówno utleniające, jak i nieutleniające gałęzie szlaku fosforanu pentozy.

U bakterii NAM jest najczęściej przekształcany w kwas nikotynowy (NA) przez nikotynamidazę, która jest zintegrowana ze szlakiem Preiss-Handlera, podobnie jest w przypadku Escherichia col . U ssaków nie odnotowano aktywności nikotynoamidazy; Zamiast tego NAM przekształca się w NMN przez jeden z enzymów NAM transferazy fosforybozylowej. Chociaż większość bakterii nie ma transferazy fosforybozylowej NAM, enzym ulega ekspresji w Haemophilus ducreyi i Shewanella oneidensis .

Proste i wszechstronne metabolicznie organizmy, takie jak Escherichia coli , są często stosowane w biotechnologii do kontrolowanej ekspresji białek o pożądanej aktywności enzymatycznej. DNA kodujący takie enzymy jest często wprowadzany do bakterii przez wektory ekspresyjne, takie jak układ pET z Novagen. Wektory pET transformuje się w bakterie wyrażające polimerazę RNA T7, takie jak E. coli BL21 (DE3). Kontrolę ekspresji enzymów uzyskuje się za pomocą promotora lac , który włącza ekspresję tylko w obecności laktozy (również metabolizowanej jako źródło węgla) lub jej syntetycznego analogu strukturalnego, izopropylo-1-tio-β-D-galaktopiranozyd (IPTG) ( nie metabolizowany, o stałym stężeniu podczas procesu wzrostu). Ponieważ metabolizm bakteryjny jest wszechstronny, zmiana źródła węgla i stężenia substratów enzymatycznych o średniej zawartości suplementów są kluczowymi czynnikami, które należy wziąć pod uwagę w procesie biotechnologicznym.

Mając na celu rozwiązanie obecnego problemu wysokiej ceny NMN , w naszej poprzedniej pracy zaproponowaliśmy metodę oczyszczania z komórek bakteryjnych. W celu dalszej optymalizacji procesu, ponieważ udało nam się znaleźć tylko jedną metodę produkcji drożdży, w niniejszym badaniu zaproponowano prostą i opłacalną metodę produkcji biotechnologicznej NMN w Escherichia coli .

Wyniki

Transformacja bakteryjna

Wyrównanie wielu sekwencji aminokwasowych wygenerowane dla przypuszczalnego NadV z Haemophilus ducreyi, NadV, Shewanella oneidensis MR-1 i Nampt z Mus musculus , wykazuje wysokie podobieństwo (ryc. S1), czyniąc wszystkie te enzymy kandydatami do procesu biotechnologicznego.

Przekształcony E. komórki coli z genami nadV (NAMPT) przenoszonymi przez plazmidy pET28a (+) tworzyły kolonie na płytkach z agarem LB uzupełnionych kanamycyną. Nie wykryto kolonii na płytkach zaszczepionych nietransformowanymi komórkami bakteryjnymi. Elektroforeza plazmidowego DNA na żelu agarozowym izolowanym z tych kolonii potwierdziła obecność plazmidów Nampt-PET28a, pET28a-soNadV lub pET28a-hdNadV w E. coli DH5α (rysunek uzupełniający S2A, ścieżka 2, 3, 4). Pasma DNA pasowały do pasm z E. komórki coli BL21 (DE3) pLysS (rysunek uzupełniający S2A, linia 6, 7, 8), które transformowano odpowiednimi plazmidami ekstrahowanymi bezpośrednio z E. coli DH5α. W nietransformowanym E. Komórki coli BL21 (DE3) pLysS, stosowane jako kontrola negatywna, obecność plazmidu pLysS potwierdzono za pomocą elektroforezy, pasmo o znanej długości 4886 pz (Dodatkowa ryc. S2A, ścieżka 5) pokazano na żelu agarozowym.

(Więcej danych eksperymentalnych można znaleźć na oryginalnej stronie internetowej: https://www.nature.com/articles/s41598-018-30792-0#Sec14)